Biologie Moléculaire
PCR et PCR en temps réel
PCR
PCR = amplification de gènes in vitro
- Avoir notion du mix de PCR en général et savoir à quoi sert chaque ingrédient:Tampon, MgCl2, dNTP, Taq polymérase, H2O, amorces, ADN matrice
- Connaître le cycle de la PCR du point de vue moléculaire (schéma) mais aussi le cycle du thermocycleur (en général)
- Avoir notion des différentes enzymes qu'on peut utiliser pour PCR, prendre conscience des différents kits commercialisés pour les laboratoires de diagnostics et/ou de recherche
- Revoir les enzymes à bouts cohésifs, à bouts francs...
- Bien maîtriser les différents témoins à faire lorsque l'on fait une réaction de PCR (témoins négatifs, positifs, ...)
- Bien maîtriser le gel d'agarose, sa composition et le rôle des ingrédients. Revoir la notion de résolution versus détection des tailles des pb (voir marqueurs de taille). Revoir les méthodes de détections avec les bains de BET ou le BET dans le gel ou dans l'échantillon. Avoir notion qu'il existe de nouvelles molécules sur le marché comme le SyberGreen, SyberSafe, etc
- Avoir notion de la purification d'un produit de PCR :extract gel, colonnes, résines, ... avoir conscience des kits commerciaux
- Exemples d'applications de la PCR : détections d'agents pathogènes, se renseigner sur internet, regarder des vidéos sur youtube
PCR en temps réel
- Bien maîtriser la PCR « classique »
- PCR en temps réel = on détecte au fur et à mesure le signal grâce à une molécule « reporter » par ex le sybergreen qui s’intercale entre les bases ADN et qui peut-être excité et donc renvoyer de la fluorescence
- PCR classique : détection par gel d'agarose
- PCR en temps réel : courbe de fluorescence
- Notion du Ct = « cycle seuil » ou « Cycle Threshold » = nombre de cycle d'amplification nécessaires pour obtenir un signal fluo statistiquement significatif par rapport au bruit de fond
- Plus le Ct est petit, plus l'échantillon est concentré
- Si Ct = 25 cad au départ bcp d'ADN; Si Ct = 35, au départ peu d'ADN : il a fallu bcp de cycle pour le détecter
- Avoir notion des méthodes de détections et connaître les + et – de chaque techniques :
- SyberGreen = se lie à l'ADN : agent intercalant dont l'émission de fluorescence augmente lorsqu’il est lié à l'ADN
- Sondes Taqman : une sonde spécifique se fixe sur l'ADN. Elle ne fluorescence que lorsqu'elle est hydrolysée (= coupée). Utilisation de la méthode FRET + activité 5' -exonucléasique de la TaqPol. Plus il y a de cycles, plus il y a de fluo.
- FRET : hybridation de deux sondes spécifiques sur une séquence cible se fait en « tête à queue ». La proximité des deux amorces marquée par des fluorochromes entraîne un transfert d'énergie : le premier émet en vert, lors de l'hybridation ils sont rapprochés donc il transmet son énergie au second qui alors émet en rouge. L’acquisition du signal se fait donc pendant l'hybridation. L'augmentation de la fluorescence est proportionnel à la quantité d'ADN synthétisé.
- molecular beacons : sonde moléculaire en forme d'épingle à cheveux, il y a toujours une séquence spécifique de l'ADN. Une partie est marquée avec un fluorochrome émetteur, l'autre partie est marquée par un fluorochrome suppresseur = quencher. En solution il n'y a pas de fluo car le quencher réprime la fluo. Lors de l'hybridation la sonde s'hybride totalement sur l'ADN cible alors les deux extrémités s'éloigne : émission de fluo. Lors de l'élongation l'enzyme éjecte la sonde, le quencher et le fluo se retrouvent plus près, la fluo disparaît.
Pour plus d'info, recherches internet;) - Avoir notions des différents appareils de PCR en temps réel
- Connaître les avantages / inconvénients de la PCR classique versus PCR en temps réel
- Exemple d'application, la PCR en temps réel en bactériologie pour le diagnostic : Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia trachomatis, Neisseria menigitidis (méningocoque)
- Apports de la PCR en temps réel en bactériologie :
- diagnostic bactériologique : PCR quantitative ou qualitative
- étude résistance aux AntiBiotiques (ex : H. pylori)
- typage bactériens (génotypage, ex : N. menigitidis)
