Biologie Moléculaire
Hybridation Moléculaire
Hybridation
Hybridation = hybridation d'acides nucléiques, pê ADN-ADN ou ADN-ARN
Dénaturation de l'ADN
Par chaleur ou par soude.
Par chaleur : dénaturation de l'ADN bicaténaire, déstabilisation des liaisons H. La chaleur excite les molécules, on parle « d'agitation moléculaire » ce qui va faire rompre la molécule d'ADN.
Revoir l'effet hyperchrome où l'ADN monocaténaire absorbe plus que l'ADN double brins.
Par soude : ouvre les deux brins d'ADN. Sur le duplex ADN-ARN cela détruit ARN car sensible au pH alcalin : hydrolyse de l'ARN. Attention l'ARN est bcp moins stable que l'ADN.
Paramètres influençant sur le Tm de l'ADN
T°C, %GC, Force ionique (cad [sel]), longueur ADN, % formamide, % mismatch
Tm = 50% de dénaturation de l'ADN bicaténaire ; + Tm élevé, + hybride stable alors il faudra plus de chaleur pour séparer les doubles brins. Donc +Tm bas, + hybride instable.
%GC : + %GC élevé, + Tm élevé (car il y a 3 liasons H entre G et C!)
Force ionique : cad la concentration en ions dans le milieu. Les sels chargés + vont stabiliser l'ADN chargé -. + sel, + le duplex est stable et + Tm va être élevé.
Taille de l'ADN : cela a de l'influence notamment pour les petits fragments. + ADN grand, + ADN stable ; + ADN petit, + ADN instable
Molécules qui dénaturent l'ADN : Formamide et Urée. On s'en sert pour faire diminuer le Tm d'un duplex.
Les défauts d'appariement : les mismatchs influencent également le Tm d'un duplex.
Formule :
Stringeance
Dépend de la concentration en sels. + il y a des sels, + la solution est stringente et + le Tm diminue
Pour les oligonucléotides jusqu’à 20pb on peut calculer facilement le Tm :
1 AT = 2°C ; 1 GC = 4°C
ex: si 20pb avec 10[AT] = 2°C x 10 = 20°C et 10[GC] = 4°C x 10 = 40°C le Tm = 20 + 40 = 60°C
Renaturation de l'ADN
Si on dénature à haute T°C et qu'on laisse refroidir doucement alors il peut y avoir réappariement de l'ADN.
Lors de l'hybrdation il faut être au plus proche du Tm : plus on est proche du Tm plus on est spécifique lors de l'hybridation : Tm – 5°C.
La stringence influcence également l'hybridation :
- [sel] : + spécifique car – stable
+ [sel] : + stable donc – spécifique
La spécificité de l'hybridation dépend donc de la Température d'hybridation et de la concentration en sels des tampons.
Paramètres importants lors de l'hybridation
Le temps : plus on laisse du temps à l'hybridation plus il y a de probabilité que les brins d'ADN complémentaires se rencontrent.
La concentration en acides nucléiques mis au départ dans le tube : voir les quantités en excès...
Pour cela on marque la sonde !
Notre ADN d’intérêt est fixé sur un support solide (ex : puce à ADN, membrane) et on va le mettre en présence d'une sonde marquée : un ADN complémentaire à notre ADN d’intérêt qui va donc aller s'y fixer mais qui a été préalablement marqué par radioactivité, par un fluorochrome, par DIG DIGoxigénine.
Les SONDES
La sonde est : acides nucléiques qui va s'hybrider sur l'ADN, soit de l'ADN soit de l'ARN.
Sonde : molécule monocaténaire, qui doit être « marquée » car on doit pouvoir la repérer.
Lors du TP on a utilisé un marquage dit « froid » à la DIG (contrairement au marquage radioactif dit « chaud »).
Pour cela on fait une sorte de PCR ou le un des nucléotides est marqué à la DIG : d-UTP - DIG
Revoir les différents types de marquage : random priming, nick translation
Revoir aussi les techniques de puces à ADN, etc..
On obtient alors un double-brins spécifique de l'endroit rechercher sur le génome d’intérêt, c'est notre sonde. Ce double-brins est « marqué », c'est-à-dire que certains nucléotides portent une molécule DIG. Cette molécule pourra être reconnue ultérieurement par un anticorps.
Situation du TP : Quelques part dans le génome de la bactérie, nous savons que le plasmide a été intégré (entier ou partiellement). On sait en tout cas que les bactéries on intégré les gènes de l'EGFP et le gène de résistance au Chloramphénicol. On va donc se servir des ces morceaux de gènes pour faire notre sonde.
On cherche à savoir où ces gènes de plasmides se sont intégrés dans le génome de la bactérie.
On va donc faire une PCR de marquage sur le plasmide qui a été intégré, au niveau de l'EGFP afin d'obtenir un double-brin EGFP marqué à la DIG = notre sonde.
Différentes étapes de l'Hybridation - T.P.
Préparation des solutions
- 3L HCl 0,2N: HCl 37%(v/v), PM: 36,461g/mol, dHCl: 1,186. "N": normalité, cad la molarité pour un acide.
- 5L 20X SSC:Saline Sodium Citrate, 3M NaCl + 0,3M NaCirate, PM(NaCl): 58,44g/mol, PM(NaC): 294,10g/mol
- 1,5L 0,1M TrisHCl pH9,5 + 0,1M NaCl: PM(NaCl): 58,44g/mol, PM(Tris HCl): 121,07g/mol
- 400mL 10% SDS (w/v): SDs dénature les protéines: SDS déstabilise les membranes cellulaires car solubilise les lipides
- 10mL N-LaurylSarcosine 20% (w/v)
- 100mL Ethanol 100%
- 50mL Ethanol 70%
- 1,5L NaCl 5M
- 1L Tampon TrisHCl 1M pH7,5: PM(Tris HCl): 121,07g/mol
- 1L NaOH 1N: PM(NaOH): 40g/mol
- 2L TBS
- 7L Acide Maléique 0,1M + 0,15M NaCl pH7,5: PM(Acide M): 116,1g/mol
- 400mL Solution de Blocage
Transfert sur membrane
On récupère la boite avec les colonies au frigo. On va appliquer une membrane sur la boite pour y "imprimer" les colonies. Evidemment il faut penser à faire une marque repère sur la membrane (on coupe une toute petite forme de triangle sur un coté, on marque sur la boite à quel endroit se trouve la marque).
La membrane est donc l'image miroir de ce qu'il y a sur le boite.
Ensuite la membrane va subir plusieurs bains pour être hydratée puis séchée.
Attention avoir notion des précautions à prendre lors de la manipulations!!
Il faut fixer l'ADN sur la membrane, pour cela on utilise un four à U.V.: on passe la membrane dans un bain de 2XSSC puis on met la membrane dans le four en mettant les colonies face aux U.V.
Marquage des sondes
On prend 100ng de l'insert purifié dont on veut faire une sonde (volume max 15µL).
Dénaturation par incubation au Bain-Marie 100°C, 10min (attention à utiliser un bouchon à vis qui ne risque pas de s'ouvrir sous l'effet de la chaleur).
Mettre le tube dans la glace 3 à 5min.
Faire une petite centri. pour récupérer toutes les gouttelettes d'évaporation dans le culot du tube et remettre dans la glace
Ajouter au 15µL: 2µL de "nucléotides mix 10X" (1) + 2µL "dNTP Labeling mix 10X" (2) + 1µL "Fragment de Klenow" (3).
1 : mélange de nucléotides, concentré 10 fois; 2: mélange de nucléotides marqués, concentrés 10 fois; 3: enzyme
Faire un passage rapide au vortex pour tout bien mélanger.
Incuber toute la nuit à 37°C.
Test des sondes marquées
On va tester l'incorporation de la DIG. Pour cela on dispose sur une membrane: d'un côté une gamme de sensibilité avec un ADN marqué à la DIG qui est notre témoin +. On dépose également un témoin négatif : le sperm de saumon. Enfin on dépose notre sonde diluée. Une fois déposer tous les ADN, on va fixer tout ça dans le four à U.V.
Il faut ensuite faire les différentes étapes de Révélation. On dispose la membrane dans une boite de pétri sur laquelle on va faire agir différentes soltions. L'étape avec le tampon de révalation s'effectue dans l'obscurité.
Traitement des sondes avant hybridation
Dénaturation 10sec dans un bain à sec à 100°C.
Incubation dans la glace pendant 3 à 5min.
20µL de sonde dans 10mL de Tampon de préhybridation = solution d'hybridation
Hybridation
Etape de préhybridation: on sature la membrane pendant 1h. Ensuite viens l'étape d'hybridation.
Il s'agit de la solution de préhybridation + les sondes spécifiques.
On hybride sur la nuit.
Traitements post-hybridation
Après la nuit d'hybridation, on lave plusieurs fois la membrane.
Enfin viens l'étape de révélation, colorimétrique cette fois-ci car on a utilisé un marquage à la DIG. C'est à ce moment qu'on observe la colonies avec ou sans le gène d'intéret.
Exercices TP Hybridation
Exercice Hybridation n°1 en pdfExercice Hybridation n°2 en pdf