Biologie Moléculaire
Clonage des gènes
Clonage
- Avoir notion des différentes enzymes qui coupent l'ADN: DNAses, Nucléases, Exonucléases. Enzyme qui "colle" l'ADN : Ligase. Enzyme qui modifie l'ADN: phosphatase alcaline (-P) et Kinase (+P).
- Avoir notion des enzymes qui recopient l'ADN: ADN polymérase, ADN polI, Fragment de Klenow, Tap polymérase, Rétrotranscriptase, ... Enzyme qui copie l'ADN en ARN: ARNpolymérase.
- Avoir notion des différentes enzymes de restricitions. Connaitres "bouts francs" versus "bouts cohésifs". Il en existe 3 types, types de coupures, site uniques...
- Avoir en tête des cartes plasmidiques, savoir les lire correctement.
- Notion de l'opéron "Lac Z". Opéron = ensemble de gène qui dépendent d'un même promoteur
- Bien connaite le milieu de culture classique des bactéries : LB: 10g peptone + 5g extrait de levure + 10g NaCl + eau qsp 1L (éventuellement 15g d'agar pour les boites). Autoclaver 120°C, 20min. Ajouter l'Ampicilline (ou l'antibiotique de sélection), utilisation finale 100µg/mL, solution stock à -20°C: 100mg/mL.
Différentes étapes du Clonage - T.P.
Préparation des ADN
D'un côté nous avons notre produit de PCR que l'on veut introduire dans notre plasmide = insert, gène d'intéret. Il faut le couper avec les mêmes enzymes de restrictions que le plasmide pour que les deux ADN (produit PCR + plasmide) se collent bien comme il faut!
D'autre part nous avons le plasmide qui va recevoir le produit de PCR. Il faut le couper avec une enzyme de restricition qui a un site unique de coupure afin de faire une seule coupure. Il faut que ce soit la même enzyme que celle qui a coupé le produit de PCR pour que les bouts (cohésifs généralement) se collent bien comme il faut!
La digestion se fait en fonction des références de l'enzyme. Souvent à 37°C avec un tampon spécifique de l'enzyme.
Exemple d'une enzyme de restriction très connue, EcoR1 chez le fournisseur New England Biolabs - NEB : "EcoR1"
Déphosphorilation
Attention: le plasmide coupé à tendance à se recoller sur lui-même!! Cela nous donnera un "plasmide vide".. Pour éviter ce phénomène on va retirer un P en 5' sur le plasmide, c'est la "déphosphorylation".
On incube le plasmide coupé ("plasmide digéré") avec la phosphatase alacaline pendant 1h à 37°C.
La phosphatase alcaline chez NEB : "Phosphatase Alcaline"
Vérification sur gel d'agarose
Pour vérifier toutes nos étapes, il est indispensable de faire un gel d'agarose!!
--> Bien connaitre le gel d'araose, ces composants, les marqueurs de taille, la révélation...
Il faut faire migrer quelques µL de chaque ADN pour vérification. Le reste sera purifié pour ensuite être "collé". Il faut donc faire migrer : le plasmide initial encore fermé (migration du plasmide circulaire), le plasmide digéré par l'enzyme (normalement une seule bande à la taille du plasmide ex: 2455pb), le plasmide déP, le produit de PCR initial et le produit de PCR digéré.
Purification des ADN
Lors de ce TP nous avons précipité nos ADN dans de l'Ethanol 70% et Acétate de Sodium. Les plasmides ont été purifiés au phénol - chloroforme. Il est indispensable de connaitre les kits commerciaux et autres techniques de purification de l'ADN.
Ligation
Quand les ADN sont digérés correctement et propres alors on peut effectuer la ligation. Il s'afit concrètement de coller l'insert dans le plasmide! Généralement avec la T4 ligase, enzyme dédiée à la ligation de l'ADN. Suivre les recommandations du produits. La T4 Ligase chez NEB : "T4 Ligase"
Lorsque la ligation est effectuée, il faut (toujours) vérifier sur gel d'agarose:
- plasmide d'origine uniquement
- plasmide digéré par l'enzyme = témoin du plasmide linéaire
- plasmide digéré + ligase = témoin du plasmide refermé sur lui-même
- plasmide digéré + déP + ligase = témoin du plasmide linéaire qui ne devrait pas se refermé
- plasmide digéré + déP + ligase + insert = plasmide refermé avec l'insert
Bactéries compétentes et Transformation
La transformation est "l'introduction d'ADN dans une bactérie". Pour cela il faut que les bactéries soient "compétentes", c'est-à-dire aptent à recevoir l'ADN étranger.
Il existe deux types de compétentence: la "chimiocompétence" et l'électrocompétence".
- Chimiocompétence: phénomène chimique où l'on amène les bactéries à devenir globalement chargées positivement afin d'attirer l'ADN chargé négativement
- Electrocompétence: phénomène d'électroporation où l'on fait un trou dans la paroi de la bactérie : choc électrique durant lequel l'ADN va pouvoir rentrer dans la bactérie. Cela nécessite plus de temps de préparation des bactéries et surtout pas de sels
Quand les bactéries sont compétentes on peut alors les transformer. Pour cela il faut un témoin positif pour savoir que la technique a fonctionné, cad transformer les bactéries compétentes avec un plasmide natif. Puis la transformation avec notre plasmide d'intéret, cad celui qui a intégrer l'insert à cloner = "plasmide recombinant". Il faut donc bien réfléchir aux différents témoins à réaliser.
On dit alors que le plasmide est un "vecteur de clonage", c'est lui qui transporte le morceau d'ADN d'intéret (= l'insert) dans l'hôte.
Pour être un bon vecteur il faut: 1 site de réplication (ORI), 1 site de restriction unique pour une enzyme de restriction donnée (MultiSites de Clonage - MSC), un ou des marqeurs de sélections. Il existe des "marqueurs de transformation" tels que les antibiotiques, mais également des "marqueurs de recombinaison" qui traduit que le plasmide à transformer à, au préalable, bien intégrer le gène d'intéret.
Note: le gène AmpR code pour la Beta-Lactamase qui clive l'antibiotique Ampicilline. Le gène CmR code pour l'acétyltransférase qui acétyl le Chloramphénicol et le rend inactif.
--> Connaître IPTG, Xgal, colonies blanches / bleues pour la sélection sur boites. Notion d'alpha-complémentation de la Beta-Gal.
Efficacité de Transformation
Une fois que la transformation est effectuée, nous avons donc un tube avec des [bactéries + plasmide recombinant]. Pour vérifier que tout a bien fonctionné, nous étalons ces bactéries sur boites LB agar.
Théoriquement si nous transformons 1µg de plasmide, on devrait obtenir 10^7 bactéries transformées. On appelle ce rapport, "l'efficacité de transofmation" : nombre de bactéries transformées / µg de plasmide.
De façon plus pratique, nous allons étaller nos bactéries transformées sur boites de LB agar. Nous étudions les dilutions 10^-3, 10^-4, 10^-5, 10^-6, incubation à 37°C pendant 24h. Le lendemain il faut effectuer le dénombrement des unités formant colonies (UFC).
Exemple de calcul: Nous avons mis 600ng de plasmide. Théoriquement 1µg de plasmide donne 10^7 bactéries. On devrait donc obtenir 6.10^6 bactéries / µg.
Sur ce TP j'ai compté 2 UFC à 10^-3 ce qui donne 2.10^3 UFC à 10^0. Le calcul a faire est : UFC dénombrées x facteur de dilution x rapporté à 1mL x rapporté en µg / la quantité de ng déposé => 2.10^3 x 5 x 1000 / 600 = 1,67.10^4 UFC/µg de plasmide (très faible!).
Si nous obtenons des colonies intéressantes (blanches / bleues), il conviens de les repiquer sur une nouvelle boite LB afin de bien les isoler. On en profite pour faire une "PCR sur colonie" afin de vérifier qu'il s'agit bien de notre plasmide + insert. Cad à dire qu'on fait une PCR avec les amorces qui nous permettent de vérifier la présence de l'insert sur ces bactéries.
Pour faire ceci de façon pratique il faut d'abord préparer son mix de PCR et le répartir dans le nombre de tube PCR suffisant. A l'aide d'une pointe jaune, on gratte la colonie qui nous intéresse, on trace un trait sur la nouvelle boite de LB agar pour l'isolation puis avec la même pointe on la trempe dans le tube PCR correspondant à cette colonie en essuyant la pointe au fond du tube. Attention tout doit être bien annoter!! Ne pas se perdre dans les colonies, les plasmides, les tubes, etc...
Evidemment on fait un gel d'agarose en suivant. Avec un peu de chance on se retrouve donc avec une colonie qui a le plasmide d'origine + l'insert = clonage ok!!!!
Il ne reste plus qu'à remettre cette colonie en culture et ensuite faire une "Midi-prep", cad une extraction du plasmide en grande quantité pour le stocker. Youpi!!!