Biologie Cellulaire
Microscopie - Préparation
Prélever, Préparer, Révéler, Observer, Analyser
Méthode d'étude de la cellule:
- cytologie / histologie = on étudie la structure, la morphologie des cellules, l'organisation des tissus
- physiologie cellulaire / biochimie / cytogénétique = on étudies les fonctions cellulaires
Méthode d'observation: Microscopie électronique < Microscopie photonique < Œil nu
Différentes étapes:
Prélèvement – Fixation – Déshydratation – Inclusion – Microtomie – Coloration – Observation / Interprétation
Toutes ces étapes délicates peuvent modifier le prélèvement.
1. Fixation
Le protocole de fixation dépend de la technique utilisée : Microscopie photonique, Microscopie életronique à transmission (MET), Microscopie électronique à balayage (MEB).
Fixation = stabilisation des structures avec des produits qui ne perturberont pas beaucoup l'état natif. Attention il y a qd mm des modifications, il faut en avoir conscience.
Fixateurs coagulants: solvants organiques = Méthanol, Ethanol, Acétone. Ces agents retirent l'eau mais induisent des remaniements de structure modifiants la polarité des molécules. Par contre ils conservent les activités enzymatiques.
Fixateurs additifs: Formol, glutaraldéhyde, acide picrique, tétraoxyde d'osmium.. Bcp plus utilisés.
- Formol: en forme liquide ; après évaporation lente : paraformaldéhyde = poudre. + : conserve assez bien les systèmes enzymatiques.
- Formaldéhyde = fixateur de pénétration / réaction rapides. Attention réaction réversible par ajout d'eau, attention aux dégradation des échantillons.
- Glutaraldéhyde: polymérise pour donner des produits dérivés. A préparer extemporanément. Ici réaction irréversible, donc bcp plus stable que le formol. Il pénètre peu et lentement ce qui fixe très bien les tissus. Par contre les activités enzymatiques sont quasiment perdues.
- Tétraoxyde d'osmium: Il s'agit d'un agent oxydant, il complète l'action d'un fixateur avant l'inclusion en microscopie électronique. Il est toxique et oxydant. Mauvais dégrade bcp les protéines.
- L'acétate d'uranyle: régit avec les lipides et les acides nucléiques. Surtout utilisé pour renforcer le contraste des structures.
- Autres moyens: congélation brutale afin de vitrifier l'eau : soit par congélation-substitution soit par lyophylisation;très basse températures = cryométhodes. Cela évite les traitements chimiques très toxiques et nocifs.
Réalisation de la fixation: par voie sanguine = perfusion ; par immersion.
D'abord immersion avec le/les fixateur/s, puis rinçage avec un tampon pour retirer l'excès de fixateur.
Points importants :l'échantillon doit être en lame mince. Plus l'échantillon est épais, plus le temps de fixation sera long.
heures : petit fragment --> semaines : cerveau humain entier
Il faut bien orienter l'échantillon.
Lors de la fixation il y a modification de la perméabilité membranaire : pour cela il faut que le fixateur est une osmolarité équilibrée par rapport au milieu intracellulaire (ajout de sel ou sucre).
2. Déshydratation
Étape nécessaire car la plupart des milieux d'inclusion sont hydrophobes.
On réalise des bains d'alcool par paliers qui au fur et à mesure vont remplacer l'eau par l'alcool.
3. Inclusion
Le but ici est d'entourer l'échantillon par une substance dure afin de faire des coupes fines, ultrafines et régulières.
Ex : paraffine, résines hydrophobes, résines hydrosolubles.
Il faut d'abord imprégner le tissu avec le milieu d'inclusion avant qu'il ne durcisse.
Le milieu d'inclusion idéal: totalement soluble dans l'eau ; point de fusion très bas (pour ne pas détruire les protéines) ; chimiquement inerte ; doit être perméable aux réactifs, doit pouvoir polymériser dans variation de volume, de façon homogène et sans libérer de sous-produits ; facile à couper ; bonne cohésion avec les tissu.
Parafine: Surtout utilisée en microscopie photonique : méthode simple, peu coûteuse, inclusion automatisée. Pb : il peut y avoir des réactions avec des tissus.
Inconvénients : l'alcool dissout les lipides. La définition des structures tissulaires est rarement <0,6µm. Meilleure définition avec des coupes plus fines.
Les résines hydrosolubles: - résines plus dures que la paraffine = milieu de soutien plus résistant
- en photonique : 3 avantages : coupes plus fines donc meilleure résolution et détails plus fins ; moins de distorsion des tissus ; sont hydrosolubles.
Les résines Epoxy: Résines synthétiques utilisées en microscopie électronique et photonique.
Ces résines sont meilleures quant à la pénétration des tissus mais hydrophobes donc nécessité de déshydrater. Les milieux d'inclusion sont plus durs = résolution extrême en microscopie optique et coupes ultra-fines pour la MET.
4. Microtomie
= utiliser des microtomes pour réaliser des coupes fines voire ultra-fines pour la microscopie électronique à partir de blic de tissus réalisés (paraffine ou résines) afin de pouvoir observer les détails cellulaires.
5. Histologie / Techniques de contraste
histologie : méthode utilisée pour la microscopie photonique
contraste : méthode utilisée pour la microscopie électronique
1. Histologie
But: colorer les structures et/ou des constituants moléculaires pour les visualiser, localiser, identifier.
Colorant = produit susceptible de teindre une ou plusieurs structures de façon durable (caractérisée par un spectre d'absorption).
Il existe différentes types de colorations : coloration histologique, coloration structurale, coloration cytologique, coloration vitale.
Visualisation de la coloration : le colorant est un choromophore capable de soustraire des Longueurs d'Ondes à la lumières blanche = coloration.
Molécules auxochrome – chromophore, lysochromes, fluorochromes.
On peut colorer le bloc entier, ou bien sur la coupe ou in vivo.
Il y a différents types d'artefacts suivants des facteurs physiques, des facteurs chimiques, facteurs liés au tissus, état d'épuisement et de contamination du colorant.
2. Technique du contraste
Le contraste est du à la densité des différentes structures réagissant avec les électrons : plus l'objet soustrait d'électrons au faisceau, plus il est noir.
Agents contrastants : sels minéraux lourds (uranium, plomb, tunsgtène) peuvent être introduits avant la fixation (injection du traceur à l'animal et prélèvement du tissus), pendant la fixation ou après la fixation.
6. Histochimie
But: étudie des structures et des molécules particulières comme la composition chimique.
Pour être histochimique, il faut que la réaction soit spécifique.
=> témoins et contrôles sont obligatoires !!
Exemple de recherches : Mise en évidence de la nature des molécules (lipides) ; Mise en évidence de propriétés de molécules ; Mise en évidence de groupement (glycanes) ; ...
7. Histoenzymologie
Détection cytochimique des activités enzymatiques par coloration.
Principe:
1 : coupe de tissus + milieu contenant un substrat spécifique de l'enzyme
2 : l'enzyme tissulaire réagit avec le substrat pour former un produit de réaction I
3 : celui-ci est alors visualisé par réaction avec un agent colorant ajouté soit au milieu d'incubation lui-même, soit au cours d'une deuxième étape.
Pour fixer les tissus : utilisation du paraformaldéhyde 2 à 4%, à 0-4°C et en temps court pour préserver l'effet de l'enzyme.
On assure la spécificité de l'expérience en faisant des témoins !
8. Interprétation des images
Donner un sens aux images: interprétation = procurer une signification aux images observées ; détecter la présence d'une structure, d'une molécule, d'une fonction chimique et de les localiser au niveau de la cellule, du tissus, de l'organe ou de l'organisme.
Ici : reconnaissance de formes, des contrastes, des couleurs.
Difficultés: incidences de coupe et artefacts.
Incidence de coupe: les images visualisées sont dans un plan à deux dimensions 2D. On souhaite reconstituer un monde réel à 3D ! Si possible bien orienter le bloc par rapport au plan de coupe. Souvent coupe des structures au hasard...
Se méfier des artefacts:
a) les artefacts sont des images artificielles créées par la technique.
b) les déformations des tissus
c) mauvaise préservation des tissus.