Biologie Cellulaire
Culture Cellulaire : Généralités
La technique de culture de cellules trouve son origine dans les travaux des physiologistes et embryologistes de la fin du XIXème siècle, mais les véritables débuts de l'ère des cultures de tissus se situent au début du XXème siècle, lorsque HARRISSON (1907), puis CARREL (1912) mirent en culture avec succès dans du coagulum des explants issus de divers organes de la grenouille puis du poulet.
Diverses améliorations furent apportées et un pas décisif fut enfin franchi en 1936 lorsque SABIN réalise les premières cultures de virus de la poliomyélite sur tissus nerveux embryonnaires humains. ENDERS (1949) montra quelques années plus tard qu'il était possible de cultiver ce même virus sur d'autres tissus humains : peau, muscle, intestin.
Ces améliorations furent :
1. La généralisation de l'emploi de la trypsine pour disperser les cellules.
2. La pratique de la culture cellulaire directe sur verre neutre sans interposition de plasma coagulé (DULBECCO - 1952, YOUNGER - 1954) qui achevèrent de donner aux cultures de tissu l'essor considérable qui n'a cessé de se poursuivre jusqu'à nos jours.
La mise à disposition sur le marché, des cultures cellulaires, a véritablement révolutionné la biologie des 40 dernières années, puisque les cellules vivantes, le plus souvent originaires de vertébrés, sont apparues de plus en plus comme un outil de choix et ceci dans de nombreux domaines tels que la microbiologie, la biochimie, et l'embryologie.
La culture cellulaire possède de nombreux avantages :
• Elle fournit une source continue et homogène de cellules utilisables aussi bien en biochimie, que dans le domaine médical et dans celui de la santé.
• Les cellules en culture, à l'inverse des cellules in-vivo peuvent être manipulées très facilement et de bien des façons.
• Les cultures cellulaires peuvent être congelées sans que cela affecte leur potentiel multiplicatif ou leur patrimoine génétique.
• L'utilisation des cultures cellulaires, en limitant celle des animaux de laboratoire, permet de minimiser le coût des expérimentations, et de limiter en nombre le sacrifice des animaux de laboratoire.
Méthodologie des cultures cellulaires
Obtention des cellules
Au sein d'un organisme vivant, il existe deux types de cellules :
- Les cellules libres ou circulantes et celles qui vivent en cohésion les unes avec les autres et constituent un tissu. Les cellules circulantes sont obtenues par prélèvement suivi de centrifugation.
- Les cellules organisées en tissu doivent être isolées soit par des méthodes de dissection, soit par des méthodes enzymatiques (action d'enzymes protéolytiques).
1. Les méthodes de dissection
Ce sont les plus anciennes.
À partir de tissu mou, de petits morceaux sont dilacérés et passés plusieurs fois à travers une pipette, puis la suspension obtenue est filtrée et mise en culture. Dans les autres cas, des explants sont réalisés en découpant le tissu en petits morceaux de 1 à 3 mm2 déposés dans des flacons de culture, et à partir desquels les cellules vont migrer, se diviser et coloniser la surface.
2. Les méthodes enzvmatiques
Elles sont basées sur l'activité protéolytique d'enzymes utilisées pour séparer les cellules de la trame protéique les environnant.
L'enzyme très souvent utilisée est la trypsine, pour les tissus riches en collagène on utilise la collagènase, parmi les autres protéases, citons la dispase, protéase neutre et la pronase, mélange de protéase neutre et alcalin.
Avantages et limites comparés.
Si le tissu à mettre en culture est très petit, la méthode des explants est souvent préférée. Le temps nécessaire pour obtenir des cellules peut être long et atteindre plusieurs dizaines de jours. Le type cellulaire recherché est rarement le premier à « sortir » de l'explant.
En revanche les enzymes sont souvent néfastes pour la membrane cellulaire et si l'on n'y prend pas garde, on peut retrouver un nombre important de cellules non viables après action enzymatique.
Méthodes de cultures
1. Cultures stationnaires ou en mono-couches
Ce type de culture est basé sur l'affinité des cellules pour un support.
Celui-ci peut-être du verre ou du plastique. Il peut être recouvert ou non de collagène, de gélatine ou encore d'éléments de la matrice extra cellulaire comme la fibronectine, la laminine ou une combinaison de ces composants.
Les cellules peuvent aussi former une mono-couche sur des billes ou micro-porteurs. Ces derniers peuvent être aussi recouverts d'un substrat.
Plusieurs systèmes de maintien des cellules existent:
- Les systèmes clos : flacons placés dans des étuves bactériologiques et dont le milieu n'est pas changé.
- Les systèmes semi-clos : l boites de Pétri ou flacons placés dans des étuves spéciales dont l'atmosphère est contrôlée par l'arrivée permanente d'un mélange gazeux composé de 95% d'air et de 5% deCO2, 37°C.
- Les systèmes ouverts ou systèmes de perfusion : les chambres de Rosé, de Pomerat ou autre, utilisées surtout pour des études nécessitant une observation longue au microscope, par exemple: la micro-cinématographie.
2. Cultures en suspension
Ces cultures se font surtout en « bio-réacteurs » permettant le maintien d'une densité cellulaire et d'un environnement gazeux constants, l'addition de milieu frais et le recueil de milieux « conditionnés ».
Condition de culture
Le premier stade indispensable pour réaliser une culture cellulaire est la fixation de la cellule sur un support.
Cette fixation fait appel à deux adhésivités différentes :
- l'adhésivité primaire, phénomène physique qui, quelle que soit la polarité de la cellule ou du plastique se fait grâce à l'eau, plus exactement au dipôle de l'eau, à la polymérisation de l'eau indispensable comme intermédiaire.
- l'adhésivité secondaire se fait grâce à des protéines d'adhésion, comme la fibronectine, la lamiline, le collagène, les lames basales (environ 50 molécules différentes fabriquées à partir de fibroblastes).
L'adhérence cellulaire comprend les contacts cellule-matrice extra cellulaire et les contacts cellule-cellule. L'ancrage correspond uniquement à l'adhérence d'une cellule à la matrice extra cellulaire.
La signalisation issue de l'ancrage fait intervenir des ligands qui appartiennent aux composants de la matrice extra cellulaire et des récepteurs à la surface des cellules nommés intégrine.
Facteurs d'attachement et matrice extra cellulaire:
L'adhérence normale, la croissance et le développement de différents types de cellules dépendent de facteurs d'adhérence et de composants matriciels extra cellulaires. Si certaines cellules sont capables de synthétiser ces composants, d'autres, par contre, ont besoin d'un apport externe notamment lors de cultures sans sérum.
Les facteurs d'adhérence peuvent être rajoutés aux milieux de culture. Ce sont pour la plupart :
- le collagène,
- la fibronectine cellulaire,
- la gélatine,
- la laminine,
- la vibronectine,
- la thombospadine.
• La fibronectine est une glycoprotéine de 440-450 KDa composée de 2 sous unités liées du côté C-terminal par une paire de ponts disulfures. Dans le plasma, la fibronectine est présente sous forme dimérique (soluble) et dans la matrice extra cellulaire à la surface des cellules, la fibronectine est sous forme polymérique (de haut poids moléculaire).
La principale fonction de la fribonectine est l'adhésion des cellules à la matrice extra cellulaire. Elle peut être utilisée comme supplément de culture dans un milieu sans sérum.
• Le collagène IV est un composant ubiquitaire des membranes basales. Il joue un rôle dans l'adhésion.
• La laminine est un composant majeur de la membrane basale. C'est une glycoprotéine de 900 Kda composée de trois sous unités. Elle se fixe à des composants de la membrane basale (collagène IV, héparum, sulfate protéoglycan), ou à des récepteurs à la surface des cellules (intégrine).
Elle régule aussi la croissance d'un grand nombre de types cellulaires.
Une autre substance peut également être rajoutée :
La polylysine, molécule synthétique qui amplifie l'interaction électrostatique entre les ions négatifs de la membrane cellulaire et les ions positifs de la surface cellulaire présents dans les facteurs de fixation de la surface de la culture.
Evolution des cellules en culture
Classiquement l'entretien d'une culture de cellules comprend : le changement de milieux à intervalle régulier, et la réalisation d'un « passage » lorsque le stade de confluence cellulaire est atteint.
En culture, les fonctions différenciées des cellules ont tendance à régresser, voire à disparaître : cette dédifférenciation est observée pour de nombreux types cellulaires, elle touche aussi bien la morphologie que les caractères physiologiques.
Le maintien des fonctions spécifiques de certaines cellules, demande des conditions très particulières de culture.
La matrice extra cellulaire
Les tissus des organismes pluricellulaires ne sont pas uniquement composés de cellules. L'espace extra cellulaire représente une partie importante de leur volume, il est rempli par un enchevêtrement complexe de macro molécules qui constitue la matrice extra cellulaire. Cette matrice est principalement constituée de polysaccharides, de glycosaminoglycanes et de protéines fibreuses qui sont synthétisés et sécrétés par les cellules.
Le collagène est la protéine fibreuse majoritaire de la matrice extra cellulaire. Sa principale caractéristique est sa structure quaternaire hélicoïdale à trois brins qui s'assemblent ensuite en fibrille pour organiser la matrice extracellulaire et la lame basale.
La matrice permet de maintenir la structure du tissu et influence aussi la différenciation, la migration, la profilération et la forme de la cellule avec qui elle est en contact.
Les interactions cellules-matrices extra cellulaires sont très importantes dans le processus d'embryogenèse, de différenciation, de croissance, de migration cellulaire et de répartition tissulaire.
Une des plus importantes conséquences de ces interactions cellules-matrices extra cellulaire sont l'adhésion, l'étalement et la migration des cellules cultivés in vitro.