Biologie Moléculaire et Cellulaire

P.C.R. : POLYMERASE CHAIN REACTION

P.C.R.: Méthode rapide d'amplification d'une séquence déterminée d'A.D.N. à partir d'une matrice.
Elle permet d'obtenir plusieurs millions de copies identiques de cette séquence. Elle fut inventée par Kary B. MULLIS en 1985 (Entreprise Cetus en Californie). Il travaillait sur le diagnostic d'HbS chez des nouveaux-nés. La première publication date du 20/12/85 parut dans Science.

1. L'Histoire de la P.C.R.

La P.C.R. d'après MULLIS.

cf. poly doc.1

Dans un épendorf mettre: ADN + Tampon Tris NaCl MgCl2 + dNTP + PCO3 – PCO4 à 1μM = amorces = démarrage de la polymérisation.
Chauffage à 95°C pendant 5 min: l'ADN bicaténaire donne ici 2 ADN monocaténaires.
Centrifugation : tout l'ADN se retrouve au fond du tube.
Transfert à 30°C pendant 2 min : hybridation des amorces.
Ajout de la polymérase (toujours à 30°C) = Fragment de Klenow (c'est une partie de la PALE d'E. Coli, sans activité exonucléasique 5' – 3' ).
Ce cycle est répété 19 fois.
Ils doivent, à chaque cycle, rajouter le fragment de Klenow car sa température optimale et de 30°C.
Ce cycle théorique a permis d'amplifier 200 000 fois le fragment étudié. Amplification = 2 ^nbr de cycle ( ~ 106 fois).
Aujourd'hui en 2h30 on obtient une matrice amplifiée 35 fois.

Hoffaman LaRoche et la Licence.

Le Brevet de la P.C.R. a été établit entre 1988 et 1989. Il revient à 3 millions de dollars et un droit de propriété de20 ans. MULLIS en récupère seulement 10 000 dollars.
En 2004 la Licence a rapporté:
→ Redevance: 89 millions d'euros (pris de la Licence dans l'achat d'un appareil),
→ Réactions, kit, Enzymes: 675 millions d'euros.
cf. poly. Doc. 2

1993.

MULLIS reçoit le Prix Nobel.

2. La P.C.R. de nos jours.

La méthode de MULLIS a été perfectionné. La P.C.R. permet maintenant d'amplifier des séquences allant de 10Kpb à 50 Kpb au maximum.

Les composants.

La matrice ADN:

Il faut obligatoirement un ADN double-brin ou ADNc. Cette matrice doit-être propre, c'est-à dire qu'elle ne doit pas contenir de substances chimiques susceptibles d'inhiber la polymérase (phénol, acétate, éthanol, EDTA, autrement dit les réactifs habituels des extractions d'ADN). La matrice doit y être en quantité suffisante, c'est-à dire entre 10 et 100 brins d'ADN.

Les amorces:

Elles doivent contenir entre 18 et 30 nucléotides avec 30 à 40% de G-C. Il doit s'agir de séquences complémentaires de l'ADN à amplifier de part et d'autre de la séquence. Leur Tm doit être compris entre 55 et 65°C. Il faut que le Tm des deux amorces soit proche et inférieur de 5°C.
Hybridation : T°C < 5°C par rapport à la température moyenne des amorces pour être sur que les deux amorces s'hybrident. Il ne faut pas de séquences complémentaires au sien des deux amorces. Elles doivent avoir leur 3'OH libre afin de permettre le démarrage de la polymérase.

La polymérase:

cf. doc. 3

La première utilisée fut le Fragment de Klenow.
Maintenant on utilise des polymérases thermorésistantes qui peuvent travailler à hautes températures. Elles sont extraites d'ArcheBactéries extremophiles. En dehors (de Pfr, Taq clonée,) n'ont pas d'activité « proof reader » = activité exonucléasique 3' – 5'; il y a donc un plus grand taux d'erreurs lors de la Transcription.
Les enzymes ont besoin de tampons particuliers, en général on utilise du Tris pH 8 – 8,5. Elles ont aussi besoin de CoFacteurs comme le Mg2+ et également de cations comme le NH4+ et le K+ qui vont stabiliser l'ADN simple brin et les amorces. Besoin de nucléotides.

Le thermocycleur:

Il s'agit d'un appareil qui permet le chauffage et refroidissement rapidement. Maintenant il possède un couvercle chauffant (~ 100°C) qui permet l'évaporation des réactifs.
Auparavant, on ajoutait de l'huile sur les épendorfs.

La procédure.

cf. poly. doc. 4

Il y a trois étapes qui sont répétées.

La dénaturation:

On sépare les deux brains d'ADN par rupture des ponts hydrogènes grâce à un chauffage d' ~ 94°C. La première dénaturation est généralement plus longue pour assurer une bonne séparation de la matrice ADN et éventuellement des amorces.

Hybridation des amorces:

On diminue la température du mélange réactionnel. Cette température est fondamentale pour rendre la fixation spécifique.

Élongation:

Température ~ 72°C, à une vitesse d'~ 1Kpb/min.
Au bout de 30 cycles il y a 100% de séquences spécifiques dans le milieu réactionnel. La dernière élongation est plus longue pour assurer que toute la matrice ADN est bien copiée.

La P.C.R. au laboratoire.

Il est nécessaire de prendre des précautions au laboratoire car la P.C.R. est une méthode très sensible. Il faut éviter la contamination par des ADN étrangers. Donc dans beaucoup de laboratoires on organise différentes salles pour faire la P.C.R.:
→ 1 salle pour extraire l'ADN,
→ 1 salle pour faire le mélange réactionnel,
→ 1 salle pour faire l'amplification.
A chaque salle est dédiée un matériel spécifique qui doit être stérile, sans oublier les gants. Comme on travail avec des petits volumes, il est nécessaire de bien agiter après ajout de chacun des réactifs.
Pour valider la P.C.R. et contrôler le bloc où l'on fait la manipulation, il est nécessaire de faire un contrôle négatif (tout sauf l'ADN remplacer par de l'H2O).

3. La P.C.R. et ses applications.

Depuis 1985, beacuoup de méthodes de P.C.R. ont vu le jour.

Principales évolutions.

RT-PCR:

« Reverse Transcriptase PCR ». Elle permet d'amplifier indirectement des ARN. Ici la PCR est précédée d'une transcriptase inverse qui permet le passage de l'ARN vers l'ADNc grâce à une enzyme Reverse Transcriptase (enzyme virale).

Nested-PCR:

Méthode mise au point pour pouvoir amplifier d'une manière plus spécifique. Il y a deux PCR successives. La première PCR avec un couple d'amorces définies. Les amplifiats obtenus servent de matrice pour la seconde PCR qui possède alors un couple d'amorces plus internes dans la séquence.

PCR Quantitative:

Ici on quantifie en temps réel la quantité de produit synthétisé et, par le biais d'un calcul, on détermine la quantité de matrice initiale.
Elle est beaucoup utilisée en Biolgie de Recherche et de Diagnostic. On veut notamment savoir la quantité d'ADN produit à telle période, par exemple. Ici on mesure grâce à un fluorimètre qui mesure le taux de dNTP fluos.

Applications:

cf. doc. 6

“ Finger printing” = empreintes génétiques:

Taxonomie génétique.
Diagnostique de paternité.
Police scientifique.
Utilisation d'amorces d''ADN qui vont augmenter des zones du génome très variables.