Biologie Moléculaire et Cellulaire

COURS VECTEURS DE CLONAGE

1. Propriétés attendues.

Pouvoir se répliquer dans la bactérie : posséder une origine de réplication bactérienne fortement amplifiable : petite taille car la réplication est plus courte posséder des sites de restriction permettant d'introduire le fragment d'ADN à cloner.
2 marqueurs :
- marqueur de transformation : permet de faire la différence entre les bactéries transformées (ayant reçu le vecteur) et les autres.
- marqueur de recombinaison : différencier entre les bactéries ayant reçu le vecteur seul de celles.ayant reçu le vecteur recombinant (cad avec l'ADN d'intérêt).
3 types de vecteurs bactériens : plasmidiques (plasmide), viraux (bactériophage), phagemides ou cosrnides (phage + plasmide, artificiels)

2. Plasmides

Molécules d'ADN bicaténaire circulaire, extrachromosomique, capables de se répliquer indépendamment de la cellule hôte, transmissibles à la descendance de façon stable.
Ils sont facultatifs : ne portent pas d'informations génétiques nécessaires à la bactérie mais peuvent apporter des avantages sélectifs (résistance aux ATBs).
Les activités biologiques apportées par les plasmides naturels concernent 3 domaines principaux : la résistance aux ATBs et métaux lourds, le pouvoir pathogène, le métabolisme taille des plasmides naturels varie entre 1 et 400 kpb selon le plasmide, le nombre de copies de plasmide par bactérie varie (1 à 20).
En pratique, les plasmides utilisés en laboratoire comme vecteur de clonage sont tous des plasmides artificiels créés à partir de plasmides naturels auxquels certaines séquences ont été ajoutées (marqueurs de sélection, par exemple).

2 exemples:
Première génération : pBR322 (poly)
Origine de réplication : colEl (origine de réplication d'un plasmide de E. coli)
2 gènes de résistance : ampicilline et tétracycline qui peuvent servir l'un et l'autre de marqueur de recombinaison ou de marqueur de transformation
Exemple : On clone au niveau du site EcoRV : marqueur de transfo est Amp et marqueur de rec est Têt. Raisonnement inverse si on clone au site Pstl.
Comment faire la sélection ? en 2 étapes : repiquage nécessaire sur une boite + Amp puis sur une boite Amp + Têt. Celles qui ne poussent pas sur Amp + Têt sont celles qui ont intégré un plasmide recombinant.

Seconde génération : pUCIS (poly)
Origine de réplication colEl
Amp, marqueur de transformation
lacZ : sites de restriction, marqueur de recombinaison
Introduction d'un gène dans lacZ, plus de synthèse de la bétagalactosidase. Or cette enzyme clive un composé chromogène le X-gal qui est incolore en X + gal qui est bleu.
Si expression betagal : colonie bleue.
Si pas expression : colonie blanche.
En fait, ce plasmide ne porte pas tout le gène lacZmais seulement le peptide alpha (lacZo).

Système inductible
Gène lacZ appartient à l'opéron lactose.

Lactose : inducteur et substrat.
IPTG : inducteur gratuit car n'est pas hydrolyse par la ßgalactosidase.
Colonies blanches : recombinantes, ßgal.
Colonies bleues : non recombinantes, ßgal.

3. Bactériophages : l'exemple du M13 (poly)

Phage de E. coli - ADN monocaténaire circulaire de 6400 nucléotides. Se fixe sur les pili des bactéries mâles.
Cycle non lytique : ne tue pas les bactéries infectées mais retarde leur croissance (poly)
lere étape : adsorption sur le pi lus avec une désencapsidation
2èmc étape : synthèse du brin négatif —> Forme intermédiaire de réplication à double brin (replicative form “RF”)
3eme étape : réplication de la RF
4eme étape : synthèse des protéines de phage
5 me étape : encapsidation du brin +.
La forme réplicative est double brin donc se manipule comme un plasmide (poly)
Introduction de marqueur de recombinaison : clonage dans lacZ donc sélection bleu/blanc
Marqueur de transformation : plage d'inhibition de croissance.
En pratique : boites LB + bactéries transformées + bactéries indicatrices (E. coli non transformées).
Bactéries indicatrices forment un tapis. Les bactéries transformées vont produire des phages qui vont infecter les bactéries indicatrices et donc former des trous qui contiennent des phages recombinants.

4. Phagemide et cosmide

Combinaison plasmide-phage : réplication plasmidique et encapsidation phagique (cosmide) - réplication phagique ou plasmidique (phagemide).
Avantage : permet d'insérer des fragments d'ADN plus grands (de 30 à 45 kpb pour les cosmides).
1 exemple : pBS (poly), phagemide dérivé du pUCIS avec une origine du phage marqueur de transformation : ampicilline marqueur de recombinaison : lacZ.